EB病毒相关性肝内胆管癌的临床病理特征

研究背景

肝内胆管癌(Intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)是第二常见的肝脏恶性肿瘤，其病因和发病机制尚不完全清楚。因为其生物侵袭性、较差的可切除性以及目前有限的治疗方法，ICC患者生存率低。目前，大约50%的病例发病危险因素尚不明了。

EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)与多种呼吸道/消化道肿瘤有关，但EBV感染与ICC发病的关系尚不清楚。目前关于EBV相关性ICC(EBVaICC)的证据水平仅基于病例报告和小样本报道。值得注意的是，以前报告的绝大多数EBVaICC病例发生在亚洲，且为华人，显示出显著的种族和地理分布特性。到目前为止，对EBVaICC的了解还不足，合适的治疗方案仍然未知。因此，需要系统和深入的了解，以进一步阐明这一罕见的实体瘤，并提供对于发病机制和治疗策略有价值的见解。

研究方法

这是一项回顾性研究，研究纳入了例年4月至年5月期间在中国广州中山大学肿瘤中心进行了首次手术切除的ICC患者。存活患者的中位随访期为50个月。研究人员采用EBV原位杂交技术对肿瘤石蜡组织进行检测，比较EBVaICC与nonEBVaICC的临床病理参数，并采用免疫组化、双重染色、巢式PCR、多重免疫荧光染色、荧光原位杂交和全外显子组测序等方法，分析EBV感染情况、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和EBVaICC的基因组特征。

研究结果

1.EBV的患病率及ICC感染情况

在原发性ICCs中检测到6.6%(20/)患者具有EB病毒编码的RNA(EBV-encodedRNAs，EBERs)表达，而在其他类型的胆管癌中均未观察到EBERs，如肝门周围胆管癌(pCCA)，远端胆管癌(dCCA)，混合性肝细胞和胆管癌(cHCC-CCA)和肝细胞癌(HCC)。双重染色显示仅在EBVaICC肿瘤细胞中检测到EBV，而所有EBVaICCs对EBNA1呈阳性，但对LMP1和EBNA2呈阴性，这表明EBV属于潜伏Ⅰ型感染。巢式PCR检测20例EBVaICC结果显示EBV呈单克隆形式存在。

2.EBVaICC患者临床特征

EBVaICC患者年龄24～68岁，中位年龄46.5岁。女性占优势，男女比例为1:3。所有患者均为中国人。10例患者(50%)显示HBsAg血清反应阳性，仅1例患者(5%)有组织学证实的肝硬化。19例(95%)患者存在孤立性肿瘤。根据AJCCTNM分期(第8版)，14例(70%)患者分为Ⅰ/Ⅱ期，6例(30%)患者分为Ⅲ/Ⅳ期。15例可用病例中有2例(13.3%)血清EBVDNA拷贝/毫升。

3.EBVaICC患者的形态学免疫表型

EBVaICC的病理资料，包括组织学，免疫组化和原位杂交。组织学上，淋巴上皮瘤样(LEL)亚型和常规型(CT)ICC在EBVaICC中分别占比45%(9/20)和55%(11/20)。在所有LEL亚型EBVaICC的病例中肿瘤内均发现次级淋巴滤泡，但在任何EBVaICCCTs中均未发现次级淋巴滤泡。所有EBVaICC病例不同程度表达细胞角蛋白(CK7和CK19)，并且呈微卫星不稳定性错义修复蛋白(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)阳性表达。

4.EBVaICC与nonEBVaICC患者之间的临床病理特点

除HBV外，EBV感染与ICC的任何已知危险因素均无显著相关。与nonEBVaICC患者相比，EBVaICC主要发生于女性(75.0%对37.8%)，年轻患者(中位年龄46.5对57.0岁)，HBsAg阳性率较高(50.0%对26.1%)，肝硬化背景较低(5.0%对27.2%)，胆石症/胆总管结石率较低(0%对16.8%)，孤立肿瘤(95.0%对70.7%)和血清CA19-9水平较低(30.0%对58.0%)(p值均0.05)。组织学上，ICC的LEL亚型在EBVaICC中显著高于nonEBVaICC(45%对0.7%，P0.)，表明LEL亚型与EBV感染有密切关系。

5.EBVaICC的预后情况

尽管EBV感染与ICC中总生存(OS)和无复发生存期(RFS)无显著相关，但EBVaICC(LEL亚型)的2年OS率(89%)明显优于EBVaICC(CT)(36%)和nonEBVaICC(38%)(P=0.)。EBVaICC(LEL亚型)的2年RFS率为67%，高于EBVaICC(CT)和nonEBVaICC的分别为27%和30%(P=0.)，但无显著差异。值得注意的是，EBVaICC的2年OS和RFS率明显优于HBVaICC和LFaICC。

6.EBVaICC的肿瘤浸润淋巴细胞

EBVaICCTIL以CD3+T细胞(84.4%±3.6%)，CD20+B细胞(9.4%±2.8%)和CD68+TAM(6.1%±1.1%)为主。在T细胞群中，CD8+T细胞占71.4%±2.9%，Foxp3+T细胞占15.0%±2.0%，CTLA-4+T细胞占13.6%±1.9%。在EBVaICC中，HLA-DR+M1TAM(77.6%±2.9%)明显高于CD+M2TAMs(22.4%±2.9%)。与nonEBVaICC相比，EBVaICC中CD20+B细胞和CD8+T细胞群体的比例显著增加，而M1/M2TAMs比例没有发现差异。

与nonEBVaICC相比，EBVaICC中肿瘤浸润免疫细胞的密度显著增加，包括CD20+B细胞，CD3+T细胞，CD68+TAM，CD8+T细胞，FOXP3+T细胞，CTLA-4+T细胞，HLA-DR+M1TAM和CD+M2TAM(所有p值均0.01)。值得注意的是，EBVaICC的肿瘤免疫微环境明显比HBVaICC和LFaICC更丰富。

与EBVaICCCT和nonEBVaICC比较，EBVaICCLEL亚型具有明显高密度的CD20+B细胞，CD3+T细胞和CD8+T细胞(P均0.05)。值得注意的是，CD20+B细胞和CD8+T细胞密度的增加分别与ICC中较长的OS和RFS显著相关(所有比较均P0.05)。

7.EBV阳性及PD1、PD-L1表达之间的关系

EBVaICC中显著过表达PD-L1-TIL，PD-L1-Tumor和PD-1-TIL。95.0%(19/20)EBVaICCs的肿瘤PD-L1阳性(IRS评分≥3)，而仅22.3%(63/)nonEBVaICCs的肿瘤PD-L1阳性(IRS评分≥3)(P0.0)；PDL1-TILs在EBVaICCs中的阳性率为%(20/20)(IRS评分≥1)，而在nonEBVaICCs中的阳性率仅为56.5%(/)(P0.0)。共有95.0%(19/20)的EBVaICCs的PD1-TILs阳性(IRS评分≥1)，而nonEBVaICCs的PD1-TILs阳性率仅为64.0%(/)(P=0.)。有趣的是，通过FISH分析，95%(19/20)的EBVaICCs中未观察到PD-L1基因扩增。

8.EBV阳性与TMIT之间的关系

研究者根据免疫组化将每个ICC样本分为TMIT四种类型Ⅰ型(PD-L1+/CD8-high)，Ⅱ型(PD-L1-/CD8-low)，Ⅲ型(PD-L1+/CD8-low)和Ⅳ型(PD-L1-/CD8-high)。结果：Ⅰ型53例(17.5%)；Ⅱ型例(40.6%)；Ⅲ型29例(9.6%)；Ⅳ型98例(32.3%)。TMIT与ICC中OS显著相关(P=0.)，但对于RFS不显著(P=0.)。

TMITⅠ亚组生存获益最好，TMITⅢ亚组生存获益最差。值得注意的是，EBVaICC与TMITⅠ显著相关，因为90%(18/20)的EBVaICC属于TMITⅠ，而nonEBVaICC仅为12.4%(35/)(P0.0)。来自病例4号的患者对包括ICIs治疗在内的联合治疗显示出显著的反应，生存期长至84个月。有趣的是，与HBVaICC和LFaICC相比，EBVaICC具有显著不同的TMIT(除了具有显著升高的TIL和具有高的PD-L1表达之外)。

研究结论

EBVaICC一种在病因、临床病理及分子遗传学等方面具有独特特征的ICC亚型。大多数病例属于TMITⅠ型，EBVaICC患者有望在免疫治疗中获益。

专家述评

该研究是迄今为止全球范围内关于EBVaICC最为大宗、系统和深入的研究:

1）EBVaICC发病显示出显著的种族和地理分布特性，其主体为亚洲华人血统患者，研究显示中国华南地区EBVaICC总体患病率为6.6%；

2）首次报道了EBVaICC的肿瘤基因组及潜伏感染的EB病毒基因组突变特征；详细阐明了该肿瘤的病理学特征，提出EBVaICC的淋巴上皮瘤样亚型患者预后好，可能与肿瘤浸润的B细胞与CD8+T细胞增多、局部抗肿瘤免疫活性增强有关；

3）率先区分4组肿瘤微环境类别，提出绝大部分EBVaICC属于TMITⅠ，并揭示该亚型较适合行免疫调节点阻断治疗，患者可能从中获益；

4）全球范围内首次报道了一例采用免疫治疗3.5年、生存时间超过7年的晚期EBVaICC病例，提供了EBVaICC患者免疫治疗获益实例。

该研究与临床病理诊断关系密切、实用性强，为肝内胆管癌的病因学研究、病理学诊断与分型、治疗策略的选择等方面提供了重要的科学依据，有望被肝内胆管癌病理学分型国际指南采纳。

专家简介

云径平教授

中山大学肿瘤防治中心病理科主任、主任医师

教授、博士生导师、临床医学科学家

广东省医学领军人才

广东省高水平临床重点专科学科带头人

华南肿瘤学国家重点实验室课题组组长

博士毕业于香港中文大学病理学系，并医院病理科进修

从事临床病理诊断工作35年，特别擅长肿瘤病理诊断

主持多项国家级和省部级科研项目，以第一负责人承担国家自然科学基金面上项目8项，国家重点研发计划骨干1项，广东省自然科学基金重点项目1项，广州市科技专项重点项目1项，牵头或参与国际国内多中心临床研究15项

在国际知名期刊发表SCI文章余篇

包括JournalofHepatology、Hepatology、Cancerresearch、AmJSurgPathol等50余篇通讯作者论著

年获得国家科学技术进步奖二等奖

Wiley医学期刊优秀作者奖

中国临床肿瘤学会（CSCO）肿瘤病理专家委员会副主任委员

中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会副主任委员

广东省抗癌协会肿瘤病理专业委员会候任主任委员

广东省医师病理分会副主任委员

广东省医学会病理学分会常务委员及广东省干部保健专家等

黄雨华教授

医学博士，副主任医师，硕士研究生导师

亚专科方向：淋巴瘤及肝脏肿瘤病理诊断，专注于EB病毒相关性肿瘤病理研究工作

世界卫生组织（WHO）淋巴造血系统肿瘤分类（第5版）编委

美国内布拉斯加大学医学中心血液病理科

香港中医院解剖与病理学系访问学者

中国抗癌协会病理学分会淋巴瘤学组委员

中国医疗器械委员会病理学分会淋巴瘤学组委员

广东省抗癌协会淋巴瘤专委会常务委员、秘书

广东省医师协会病理学分会青年学组副组长

年中国医师协会病理学分会“杰出青年病理医师”

首届中国癌症防治年度大会“人民好医生·金茶花计划·淋巴瘤领域优秀中青年专家”

“吴秉铨教育基金优秀中青年病理学者”

“广东省疑难病例病理展示竞赛一等奖”

主持省部级课题2项，作为主要成员参与国家自然科学基金项目6项

发表SCI论文40余篇，其中以（共同）第一或通信作者身份在JournalofHepatology、InternationalJournalofCancer、AmJSurgPathol.等国际著名SCI杂发表SCI论文27篇